Entwicklung qualitativer und quantitativer Methoden zum Nachweis von genetischen Veränderungen (Mutationen, GVO)

Fortmann, Carola

doi:10.24355/dbbs.084-200511080100-669

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Entwicklung qualitativer und quantitativer Methoden zum Nachweis von genetischen Veränderungen (Mutationen, GVO)

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PCR-ELISA-Systeme zum Nachweis der Faktor V Leiden-Mutation und zum quantitativen Nachweis von GVO in Soja (RRSoja) wurden untersucht. Für das Binden der PCR-Produkte an der MTP wurde alternativ zum Streptavidin/Biotin-System die Festphasen-PCR getestet und festgestellt, dass bei Einsatz geringer Zyklenzahlen eine Abhängigkeit der Signalhöhe von der Templatekonzentration erkennbar war. Für die Untersuchungen zur Mutationsdetektion im Faktor V-Gen wurde die allelspezifische PCR und der Restriktionsenzymschnitt eingesetzt. Der Restriktionsverdau von PCR-Produkten wurde in Lösung und an der festen Phase gezeigt. Für die Unterscheidung der möglichen Allelkombinationen war die Enzymaktivität an der festen Phase jedoch nicht ausreichend. Der Nachweis von RRSoja erfolgte im ELISA mittels Sondenhybridisierung. Die Quantifizierung der Template-DNA beinhaltete die Erstellung einer externen Standardkurve. Der lineare Bereich umfasste 1,5-2 Größenordnungen. Die relative Standardabweichung betrug 68 für einen 25µL PCR-Ansatz mit 37 RRSoja-Templatekopien in 10ng DNA. Aufgrund der Ergebnisse lag die Hauptursache an Schwankungen in der PCR. Eine Erhöhung der Templatekonzentration um den Faktor 5 zeigte keinen Einfluss auf die Sensitivität. Im LightCycler erfolgte der spezifische Nachweis von RRSoja mit SYBRGreenI und spezifischer Messtemperatur, womit ein Korrelationskoeffizient von 1 erreicht wurde. Trotz Hot-Start wurde die Bildung von Nebenprodukten beobachtet. Bei der Mikrochip-CE wurde ein Nachfließen der Probe nach ihrer Injektion beobachtet. Dies konnte auf sich während der Messung ändernde Füllhöhen in den Reservoiren (u.a. durch Verdunstung und Pufferfluss) zurückgeführt werden. Fluoreszenzmarkierte 9mer und 15mer Oligonukleotide wurden getrennt.

PCR-ELISA systems were examined for the detection of factor V Leiden mutation and quantification of GMO in soy beans (RRSoya). In order to bind PCR products at the MTP walls, solid-phase PCR was tested as an alternative to the streptavidine/biotin system. When only few cycles were used, a correlation was observed between signal and template concentration. Allele-specific PCR and restriction enzyme analysis were used for mutation detection of the factor V gene. Restriction digestion of PCR products was shown to take place in solution as well as in a solid-phase system. Yet enzymatic activity in the solid-phase system was not sufficient to distinguish the possible allelic combinations. RRSoya detection was carried out in an ELISA system with probe hybridization. Quantification of template DNA was accomplished via external calibration curve. The linear region included 1.5-2 orders of magnitude. Relative standard deviation was shown to be 68 for a 25µL PCR sample including 37 RRSoya template copies in 10ng DNA. The main cause of the variation could be attributed to PCR. Increasing the template concentration 5 fold showed no influence on the sensitivity of the system. The specific detection of RRSoya in the LightCycler system was accomplished be using SYBRGreenI and a specific measuring temperature. This resulted in a correlation coefficient of 1. In spite of applying hot-start conditions, unspecific by-products could be found. During microchip CE a sample flow was detected after injection. This was attributed to changing liquid levels in the reservoirs during measuring time. Reasons were among others evaporation and buffer flow. 9mer and 15mer oligonucleotides labeled with fluorophores were separated.