Screening-Automation auf Basis hohlkugelverkapselter Zellen und enzymatische Bildung von Difructoseanhydrid III aus Inulin unter thermophilen Bedingungen: Screening, Charakterisierung, Immobilisierung

Jahnz, Ulrich

doi:10.24355/dbbs.084-200511080100-708

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Screening-Automation auf Basis hohlkugelverkapselter Zellen und enzymatische Bildung von Difructoseanhydrid III aus Inulin unter thermophilen Bedingungen : Screening, Charakterisierung, Immobilisierung

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Ein Automat zum Bakterien-Screening mit in Hohlkugeln verkapselten Zellen (=Mikrobioreaktoren) wurden entwickelt. Eine 2-armige Pipettiereinheit wurde ergänzt durch halbfertige (Scanner, Schaltventile, Pumpen) und eigene Bauteile. Zur Steuerung wurde ein Delphi-Programm erstellt, das parallel Pipettierer, Greifer und Autosampler verwaltet. Ca-Alginat-Hohlkugeln mit und ohne Zellen wurden hergestellt und mit dem Automaten sortiert. Obwohl alle Einzelkomponenten funktionierten, konnte kein vollständiges Screening abgearbeitet werden. Die Genauigkeit der Eigenbauteile war unzureichend, es fehlte Peripherie zur Versorgung mit Verbrauchsmaterial. Basierend auf den Ergebnissen ist die vollständige Automatisierung möglich, wenn professionelle Komponenten verwendet werden. Durch den Aufbau ist das Steuerprogramm auf die Integration dieser Geräte vorbereitet. Es wurde die biotechnische Herstellung von Difructoseanhydrid (DFA III) aus Inulin untersucht. Stamm u0141, der eine bei 60°C stabile Inulase II bildet, wurde isoliert. Das Enzym wurde gereinigt und Molekulargewicht (44,7 kDa), IEP (pH 5,3), pH-Optimum (5,0-5,3) und Km-Wert (2,3 mmol/L) bestimmt. Ein GVO, der das Inulase-II-Gen trägt, wurde fermentiert (BTM 10,5 g/L, 1,76 Mio U/L). Inulase II wurde mit Chitosan und Glutardialdehyd quervernetzt, 67 der Aktivität dauerhaft gebunden und in Hydrogele aus PVA, Curdlan und Alginat eingeschlossen. Für 600-µm-Perlen (Anfangsaktivität 196U/g) wurden die kinetischen Daten berechnet.

An apparatus for the bacterial screening of single cells entrapped in hollow beads (microbioreactors) was developed. A 2-arm pipetting unit was supplemented with OEM-parts (scanner, valves, pumps) and own developments. For controlling the pipetting unit, a gripper and the autosampler in parallel a programme was written in Delphi. Ca-alginate hollow beads were prepared with and without entrapped cells and sorted by the apparatus. Although all components worked, no complete screening pass was possible due to lack of accuracy in some of the developed parts and due to missing peripheral devices for provision of consumables. Based on the results a thorough automation is possible when using professional components. The conrol programme is prepared for the addition of these further units. The biotechnical preparation of difructoseanhydrid (DFA III) from inulin was investigated. Strain u0141, expressing a inulase II stable at 60°C, was isolated. The enzyme was purified and molecular weight (44.7 kDa), IEP (pH 5.3), pH-optimum (5.0-5.3) and Km-value (2.3 mmol/L) determined. A GMO carrying the inulase-II-gene was fermented (biomass 10.5 g/L, 1.76 mio U/L). Inulase II was crosslinked with chitosan and glutardialdehyde, 67 of the activity were permanently bound and entrapped in hydrogels of PVA, curdlan and algiante. For 600-µm-beads (initial activity 196 U/g) the kinetic data were calculated and measured.