Identifizierung, Klonierung und biochemische Charakterisierung der pflanzlichen Sulfitoxidase aus Arabidopsis thaliana

Der Molybdäncofaktor (Moco) ist essentieller Bestandteil aller eukaryotischer Molybdoenzyme, die eine Vielzahl diverser Redoxreaktionen katalysieren und so an zahlreichen unterschiedlichsten Stoffwechselwegen involviert sind. Seine universelle Struktur in Pro- und Eukaryoten, die auf dem namensgebenden Molybdopterin als Pterin-Derivat basiert, läßt einen ähnlichen Syntheseweg in allen Organismen vermuten. In Pflanzen konnten die Molybdoenzyme: Nitratreduktase, Aldehydoxidase und Xanthindehydrogenase/oxidase beschrieben werden. Im Vordergrund dieser Arbeit standen die Identifikation, Klonierung und biochemische Charakterisierung einer zur tierischen Sulfitoxidase (SOX) homologen Proteinsequenz. Die Ableitung der Proteinsequenz zeigte, dass es sich bei diesem neuen pflanzlichen Molybdoenzym, um das erste eukaryotische Molybdoenzym handelte, welches außer dem Moco kein weiteres aktives Redoxzentrum besaß. Den molekularen Analysen der kodierenden cDNA und des genomischen Bereiches folgte nach Klonierung und Überexpression im prokaryotischen Expressionssystem die biochemische Charakterisierung der rAt-SOX.. Die spektroskopischen Untersuchungen durch die UV/vis- und EPR-Spektroskopie bestätigten das bereits durch die molekularen Analysen nachgewiesene Fehlen einer Häm-Domäne im Vergleich zu den gut charakterisierten tierischen Sulfitoxidasen. Zusätzlich konnte eine andere Lokalisation der At-SOX im Gegensatz zu den tierischen Sulfitoxidasen in Peroxisomen gezeigt werden. Hierfür wurden polyklonale Antikörper gegen die rekombinante At-SOX generiert und für immunologische Analysen eingesetzt. Es zeigte sich eine große Verbreitung im gesamten Pflanzenreich, die von Monokotylen zu Dikotylen und von krautigen zu holzigen Vertretern reichte. Während die enzymkinetischen Messungen ein im gleichen Bereich liegenden Substratumsatz zeigten, konnte durch die EPR-Spektroskopie eine deutlich divergente Natur des aktiven Zentrums nachgewiesen werden.