Posttranslationale Modifikationen rekombinanter Proteine in Baculovirus-infizierten Insektenzellen
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß das Phänomen der Akkumulation von rekombinanten Proteinen in Baculovirus-infizierten Insektenzellen an die Replikation des Baculovirus gebunden ist. Die beiden für die Produktexpression relevanten Phasen sind durch folgende Merkmale gekennzeichnet: Übergangsphase: Intrazelluläre Kompartimentierung ist noch intakt und das rekombinante Modellprotein ß-TP ist in den Transportkompartimenten des Sekretionsweges lokalisiert. Geregelter Transport und reguläre Glycoprotein-Prozessierung des ß-TP zwischen und innerhalb der Kompartimente ist effizient. ODV-Phase: Verlust der distinkten Kompartimente des Sekretionsweges und Entstehung zweier verschiedenartiger vesikulärer Strukturen, einer elektronendichten (DV) und einer elektronendurchlässigen (LV), die im Verlauf der Infektion zu Megavesikeln fusionieren. Glycoprotein-Prozessierung ist nicht mehr effizient, was sich in der Akkumulation von Glycosylierungsintermediaten ausdrückt. Signalpeptidabspaltung verläuft effizient, was auf eine intakte Translo-kalisations-Maschinerie hindeutet. Keine Unterschiede hinsichtlich der Disulfidbrückenbildung zwischen dem intrazellulär akkumulierten und dem sekretierten ß-TP sichtbar. Intrazellulär sind neben paucimannosidischen Formen (Man2-3Fuc0-2GlcNAc2) und Spuren von GlcNAcMan3-4Fuc0-2GlcNAc2 häuptsächlich high mannose type Intermediate des ß-TP vorhanden. Die Akkumulation der Glycosylierungsintermediate wird, wie sich zeigte, durch generelle Probleme des geregelten Transportes und der regulären sequentiellen Proteinprozessierung innerhalb der Megavesikel verursacht.
Using ß-trace protein (ß-TP) as a model the accumulation of recombinant proteins in baculovirus-infected insect cells has been investigated. It is unequivocally shown that the accumulation is strongly connected to the replication cycle of the baculovirus. The relevant phases for product expression are characterized as follows: Transition phase: Intracellular compartmentation is still maintained Regular transport and glycoprotein processing of ß-TP between and within these compartments is efficient. ODV-phase: Loss of distinct compartments of the secretion pathway and emergence of two different vesicular structures, electron dense (DV) and electron lucent (LV) vesicles which seem to merge to bigger ones and form megavesicles during the time course of infection. Glycoprotein processing is not efficient within these megavesicles thereby accumulating glycosylation precursors N-termini of the accumulated ß-TP were intact indicating an efficient translocation machinery. There are no differences between the secreted and the accumulated á-TP regarding to disulfide bond formation, indicating that this modification is carried out efficiently. Determination of N-Glycans of the recombiant protein has revealed that intracellularly besides paucimannosidic protein forms (Man2-3Fuc0-2GlcNAc2) and trace amounts of GlcNAcMan3-4Fuc0-2GlcNAc2 mainly high mannose type protein intermediates (Man5-9GlcNAc2) were present whereas extracellularly the majority of á-TP carried paucimannosidic N-glycans. In conclusion this work demonstrates that the accumulation of recombinant proteins in infected insect cells is caused by general problems in regular protein transport as well as in regular processing in the megavesicles.
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