Isolierung und funktionelle Charakterisierung Histon-ähnlicher Proteine aus Pseudomonas putida : in vitro-Untersuchungen zur Rolle von HU und IHF bei der Aktivierung Sigma-54-abhängiger Promotoren des TOL-Plasmids

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, erstmalig ein aus Proteinkomponenten von Pseudomonas putida bestehendes in vitro-Transkriptionssystem zu etablieren, mit dem spezifische Fragen zur Ko-Aktivierung der Sigma-54-abhängigen Promotoren Pu und Ps1 des TOL-Plasmids aus P. putida durch die Histon-ähnlichen Proteine IHF und HU untersucht werden sollten. Hierzu wurden die an der Aktivierung dieser Promotoren beteiligten Proteine IHF, HU, Sigma-54 und RNA-Polymerase-Core-Enzym aus P. putida aufgereinigt und teilweise charakterisiert. Zunächst wurde festgestellt, daß P. putida zwei Gene, hupB und hupN, die für HU codieren, besitzt, welche gleichermaßen eine HU-Mutante komplementieren konnten. In hupB- bzw. hupN-Deletionsmutanten wurde nur im Fall von hupB ein signifikanter Einfluß auf die Ps1-Aktivität festgestellt. Der Verlust beider Gene ist dagegen letal. Die biochemische Charakterisierung von HupB und HupN aus P. putida zeigte, daß beide Proteine jeweils Dimere bilden und HU-typische Aktivität, jedoch unterschiedliche Kinetiken aufweisen. Mit Hilfe des etablierten in vitro-Transkriptionssystems wurde festgestellt, daß sowohl HupB als auch HupN in der Lage ist, die Aktivierung von Pu und Ps1 zu stimulieren, wobei sich allerdings HupN als effektiver herausstellte. Die Aktivierung von Pu erwies sich in Anwesenheit von IHF und HupB/HupN zusammen als maximal. Weiterhin stellte sich der Promotor Ps1 im Vergleich zu Pu in vitro als der deutlich temperaturabhängigere heraus.