Identifizierung cis regulatorischer Elemente des anaerob induzierbaren GapC4 Promotors aus Mais in heterologen Systemen sowie Proteinbindungsstudien mit Kernfaktoren aus aeroben und anaerob induzierten Tabakblättern

Geffers, Robert

doi:10.24355/dbbs.084-200511080100-36

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Identifizierung cis regulatorischer Elemente des anaerob induzierbaren GapC4 Promotors aus Mais in heterologen Systemen sowie Proteinbindungsstudien mit Kernfaktoren aus aeroben und anaerob induzierten Tabakblättern

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Der Promotor des Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase 4 Gens (GapC4, -447/+14) vermittelt im Tabak starke, spezifische und ubiquitäre anaerobe Genexpression. Zur Identifizierung cis regulatorischer Promotorsequenzen wurden 5´-und 3´- Deletionsderivate vor ein chimäres GapC4 TATA-Box beta- Glucuronidase (GUS) Reportergen kloniert und in Tabakpflanzen transformiert. Anaerobe Induktion wurde hauptsächlich von einem 190bp Fragment (-386/-196) des GapC4 Promotors vermittelt. Innerhalb dieses Bereichs wirkte sich die Deletion eines anaeroben 'Response Elements' (cARE, -286/-266) besonders stark auf die anaerobe Genexpression aus. Mutationsanalysen zeigten, dass 30bp am 5´-Ende des AREs die Genexpresession beeinflussen. Innerhalb dieser Region ist ein 10bp Motiv (-279/-270), welches Homologie zur Myb- Konsensussequenz zeigt, zusammen mit der GapC4 TATA-Box (-46/+14) essentiell für die anaerobe Induktion. Neben der Promotoraktivität im Tabak wurde auch in Hefen sowohl mit dem GapC4 Promotor als auch mit einem ARE Tetramer starke Reportergenaktivität gemessen. Protein-DNA Bindungsstudien zeigten die Bindung eines 'high mobility' Komplexes und eines anaerob spezifischen 'low mobility' Komplexes an das ARE. Der 'high mobility' Komplex erkennt spezifisch die Sequenz GTGGGCCCG. Über der TATA-Box wurden unter aeroben und anaeroben Bedingungen unterschiedlich große Komplexe beobachtet, die vermuten lassen, dass anaerob spezifische TATA-box Binding Protein (TBP)assoziierte Faktoren (TAFs) rekrutiert werden. Das Zusammenspiel stromaufwärts gelegener Transkriptionsfaktoren mit dem TATA-Box Komplex wird im Rahmen der anaeroben Genexpression diskutiert.

The promoter of the maize glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 4 gene (GapC4, -447/+14) confers strong, specific, and ubiquitous anaerobic reporter gene expression in tobacco. To identify factors required for heterologous anaerobic gene expression, progressive 5' and 3' promoter deletions were linked to a chimeric GapC4 TATA box beta-glucuronidase (GUS) reporter gene construct and transformed into tobacco. Anaerobic induction is mediated by a region of at least 190 bps (-386/-196) of the GapC4 promoter. Deletion of a particular sequence, the anaerobic response element (cARE, -286/-266),leads to strong reduction of reporter gene expression. Mutation analysis of the ARE revealed that about 30 bps at the 5' end of the ARE are required for anaerobic induction. Of these 30 bps 10 bps (-279/-270) with extended homology to the myb consensus sequence together with the TATA box of the GapC4 minimal promoter (-46/+14) are essential for anaerobic induction. In an attempt to test the GapC4 promoter in yeast for potential transcription factor isolation the wild type GapC4 promoter as well as the tetrameric ARE was found to confer gene expression to a yeast minimal promoter. Gel shift assays with the ARE reveal a high mobility complex that is formed with nuclear extracts from aerobic and anaerobic leaf tissue while an additional low mobility complex is anaerobiosis specific. The formation of the high mobility complex requires the sequence GTGGGCCCG. The TATA box shows different complex formation under aerobic and anaerobic conditions suggesting anaerobiosis specific binding of TATA Box Binding Protein (TBP) associated factors (TAFs). The interaction of upstream transcription factors with the TATA box complex is discussed in the light of anaerobic gene regulation.