Identifizierung neuer Entwicklungsgene der Maus durch Genfallen in embryonalen Stammzellen
Ein zur Identifizierung neuer entwicklungsrelevanter Gene angewandtes Verfahren stellt die zufällige Mutagenese des Genoms eines Modellorganismus dar. Eine Möglichkeit hierfür stellt die Gene-trap Methode dar, bei der GT-Konstrukte in embryonale Stammzellen (ES) der Maus eingebracht werden. Dies erlaubt die Selektion erfolgreicher Integrationsereignisse in vitro und den einfachen Nachweis der Expression des getroffenen Gens. Aus diesen Zellen können nachfolgend mutante Tiere hergestellt werden, in denen eine in vivo Analyse des Phänotyps der Mutation möglich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Gene-trap Zellinien durch Elektroporation von ES-Zellen und nachfolgender Selektion hergestellt. Um interessante Integrationen anzureichern, wurden Zellinien ausgewählt, die eine Aktivierung des Reporters während der Differenzierung oder nach Behandlung mit bekannten Signalfaktoren wie Retinsäure oder BMP2 zeigten. Es konnten so neun unbekannte und sechs bekannte Transkripte identifiziert werden, von denen GTXVI-168 in vitro charakterisiert wurde. Diese trägt eine Integration in einem bislang unbekannten, für eine RhoGAP-Domäne kodierenden Gen. Desweiteren wurden drei Mauslinien untersucht, die aufgrund der Expression der getroffenen Gene interessant erschienen. Für alle drei Linien wurde die Integration des Gene-trap Vektors charakterisiert. Das in der Mauslinie GTIII6 getroffene Gen kodiert für ein neues PX (phox-Homologie)-Domäne Protein. Die Mauslinie 2A-53 betrifft das Pafaha1b/Lis1 (Lissencephaly) Gen und die Mauslinie GTXVI-44 trägt eine Insertion im NFkappaB1 Gen. Eine Analyse der Phänotypen zeigte eine hohe Sterblichkeit der GTXVI-44 Mäuse, die vermutlich durch eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionen und Entzündungen der Organe verursacht wird. 2A-53 homozygote Männchen sind steril und zeigen eine Arretierung der Differenzierung der Spermatozyten, während homozygote Weibchen fertil sind.
Random mutagenesis of the genome of animal models represents a valuable approach for the identification of genes that play a role in development. In the gene-trap method insertional mutagenesis is performed by introducing reporter and selector genes into the genome of mouse embryonic stem (ES) cells. This enables the selection in vitro of ES-clones carrying interesting integrations as well as the analysis of the expression patterns of the mutated genes in growing and differenting cells. Moreover transgenic mice can be generated from these mutant cell lines in order to study the phenotypes derived from the gene disruptions. In this work gene-trap cell lines were generated by electroporation of gene-trap vectors into mouse ES cells. After selection of clones carrying integrations several gene-trap lines were elected for further studies according to either the expression pattern of the reporter gene during the in vitro differentiation or to its response upon exposure to RA or BMP2. Six of the isolated sequences were identical to known genes whereas nine represented novel genes. The gene-trap line GTXVI-168 containing a gene-trap insertion in a novel gene coding for a RhoGAP protein was analyzed in detail. In addition, three mutant mouse lines carrying a gene-trap insertion were characterized. All three lines displayed an interesting reporter gene expression pattern during early stages of development. The gene trapped in GTIII-6 mice coded for a new PX (phox)-domain protein. 2A-53 mice carried an insertion in the Lis1(lissencephaly)/Pafah1b gene and the mouse line GTXVI-44 contained a disruption in the NF-kappaB1 locus. Phenotypic abnormalities resulting from the insertional mutagenesis were observed in 2A-53 and GTXVI-44 mutants. GTXVI-44 homozygous mutants developed an inflammatory phenotype and showed a decreased survival rate. 2A-53 homozygous males were steril due to impaired spermatogenesis.
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