Kultivierung und Charakterisierung von bovinen in vitro Cornea-Modellen für Permeationsuntersuchungen

Tegtmeyer, Stefanie

doi:10.24355/dbbs.084-200511080100-95

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Kultivierung und Charakterisierung von bovinen in vitro Cornea-Modellen für Permeationsuntersuchungen

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Diese Arbeit widmet sich dem Ziel ein dreidimensionales In-Vitro-Modell der Cornea zu entwickeln, um Untersuchungen zum Wirkstofftransport von Pilocarpin-hydrochlorid (PHCl) und Timololhydrogenmaleat (TM) am Auge durchführen zu können. Das organotypische Modell der Cornea besteht aus drei unterschiedlichen Zelltypen. Zunächst wurden diese verschiedenen Zielzellen der Cornea isoliert und als Primärkultur angelegt. Des weiteren erfolgte der Wiederaufbau durch Schichtung der Zellen übereinander. Die weitere Charakterisierung erfolgte mit Hilfe der Immunhistologie. Mit dieser Technik kann anhand von ausgewählten Intermediärfilamenten eine Aussage über den Grad der Differenzierung des Konstrukts getroffen werden. Für die Bestimmung der Barriereeigenschaften des in vitro Modells der Cornea wurden Permeationsuntersuchungen mit PHCl und TM durchgeführt und mit entsprechenden Studien durch exzidierte bovine Cornea verglichen. Die Arzneistoffe wurden in verschiedene Zubereitungen eingearbeitet bzw. es wurden handelsübliche Fertigarzneimittel genutzt. Die höchste Durchlässigkeit der Cornea wurde aus der rein wäßrigen Lösung gemessen. Eine Verzögerung der Permeation konnte durch viskositätserhöhende Hilfsstoffe erreicht werden. Die sich daraus ergebene Reihenfolge der Permeationskoeffizienten wurde ebenso bei den Untersuchungen an der exzidierten Cornea erhalten, wobei die Permeationskoeffizienten der Kulturen um den Faktor 2-4 höher waren als die bei Verwendung exzidierter Cornea. Die Resultate dieser Arbeit zeigen, daß es sich bei dem entwickelten in vitro Modell der Cornea um eine mögliche Alternative zur Durchführung von Permeationsstudien am Auge handelt.

The aim of the present contribution was to develop a functional three-dimensional in vitro model of the cornea to study ocular permeation of pilocarpine hydrochloride (PHCl) and timolol maleate (TM) from different formulations. The in vitro cornea was construct as an organotypic culture composed of bovine corneal epithelial cells cultivated on stromal fibroblasts in a collagen matrix with an underlying layer of bovine endothelial cells. All three different cell types had beeen isolated from primary cultures previously. The in vitro model was compared to excised bovine cornea. Immunohistochemistry staining of keratin revealed a similar morphology when compared to the excised bovine cornea. To study the transcorneal permeability, modified Franz cells were used. Drug permeation rates were analyzed by reversed phase HPLC. Comparisons of the permeation rates through excised bovine cornea and the in vitro model show the same rank order for the different formulations. In terms of the permeation coefficient KP, which was calculated from the curve, KP is about 2-4 fold higher with the cornea construct compared to the permeation through excised bovine cornea. The various formulations investigated showed significantly different permeation profiles. The pure aqueous solution of the drugs had the highest permeation rate. A reversed micellar solution of PHCl or TM, which transforms into a lamellar liquid crystal on contact with aqueous media, enabled sustained drug release at a low level. To summarize, it is possible to reconstruct bovine cornea as an organotypic culture and to use this construct as a substitute of excised bovine cornea in in vitro drug permeation studies.