Molekularbiologische Untersuchungen zur subzellulären Lokalisierung des putativen Transportprotein - P19,5k - des beet western yellows virus (BWYV) und Erarbeitung der Grundlagen für eine gentechnisch zu erzeugende Resistenz gegen das BWYV
Mit der vorliegenden Arbeit wurden die Grundlagen für eine Resistenz gegen das Westliche Rübenvergilbungsvirus (BWYV) durch die Herstellung von Virusgen-abgeleiteten Genkonstrukten erarbeitet und die Lokalisierung des vermuteten BWYV Transportproteins P19,5k untersucht. i. Herstellung und Expression der Virusgenkonstrukte Drei Hüllproteingen-Konstrukte wurden entwickelt. Im CP-Konstrukt wurde die native BWYV Hüllproteingensequenz unter die Kontrolle des CaMV 35S Promoters und Terminators gebracht. In den beiden abgeleiteten Konstrukten (CP-VPg und NLATCP) wurde die Translation des inneren Leserasters (19,5k-Gen) ausgeschaltet. Die Translation des Hüllproteingens wurde zusätzlich im NLATCP-Genkonstrukt blockiert. Die Bildung der Hüllproteingen-mRNA konnte für alle drei Konstrukte gezeigt werden. Transgen-kodiertes Hüllprotein konnte in den transgenen Pflanzen nicht nachgewiesen werden. Das P19,5k konnte in CP-transgenen Pflanzen nachgewiesen werden. Das mutmaßliche Transportproteingen des BWYV - das 19,5k-Gen - wurde in zwei Genkonstrukten von dem konstitutiven 35S beziehungsweise dem Phloem-spezifischen RolC Promoter kontrolliert. Zum Nachweis des P19,5k in transgenen Pflanzen wurde ein P19,5k- spezifischer Antikörper hergestellt. Die Bildung der 19,5k-Gen-mRNA und des P19,5k konnte in transgenen Pflanzen nachgewiesen werden. In den durchgeführten Resistenztests zeigte sich eine große Streuung der Hüllprotein-ELISA- Werte in den BWYV-infizierten N. benthamiana-Pflanzen. Durch einen deshalb zu geringen Stichprobenumfang konnten die erhaltenen Daten nicht statistisch signifikant ausgewertet werden. Lediglich für eine RolC 19,5k-Gen-transgene Linie konnte in mehreren BWYV- Resistenztests ein positiver Trend belegt werden. ii. Untersuchung der subzellulären Lokalisierung des P19,5k In einem GFP-Vektor (pCK GFP S65C) wurde die 19,5k-Gensequenz in frame zu dem gfp- Gen kloniert. Das Ergebnis war ein chimäres 19,5k:gfp
In this study the basics for genetically engineered resistance against the beet western yellows luteovirus (BWYV) were investigated by generating virus derived gene constructs (cp gene and 19.5k gene) and the subcellular localization of the putative movement protein P19.5k was determined. i. Generation and expression of virus constructs Three coat protein constructs were developed. In the CP construct the coat protein sequence (ORF3) was controlled by the CaMV 35S promotor and terminator. Two constructs (CP-VPg and NLATCP) delineated from the CP construct were constructed to prevent the translation of the inner 19.5k gene (ORF4). In transgenic plants with the NLATCP construct only the specific mRNA should be produced. The transcription of the transgenes was shown in transgenic plants. Transgene encoded CP was not detected in transgenic plants whereas P19.5k was expressed in CP transgenic plants but not in CP-VPg and NLATCP plants. The putative movement protein gene of BWYV, the 19.5k gene (ORF4), was inserted in a 35S expression cassette and a phloem specific expression cassette (RolC promotor), respectively. Expression of the P19.5k in corresponding transgenic plants was shown in western blot analysis using a specific polyclonal rabbit antibody generated. ii. Resistance tests Transgenic plants were investigated for the ability to confer pathogenesis derived resistance against BWYV. Due to the wide scatter of ELISA values and - as consequence of this fact - low number of samples, no statistically relevant differences between transgenic and non-transgenic plants could be found. Only one RolC 19.5k transgenic line displayed a positive trend in several resistance tests independent performed. Encouraged by other studies using the green fluorescent protein (GFP) to examine plant virus movement proteins (e.g. Heinlein et al., 1995), the 19.5k gene was fused with the gfp gene. In transient assays, using particle bombar
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