Charakterisierung der funktionellen Domänen von mDia1, einem Verbindungsprotein an der Schnittstelle zwischen der kleinen GTPase Rho und dem Aktin-Cytoskelett

In der vorliegenden Doktorarbeit sollten die funktionellen Domänen von mDia1 charakterisiert werden. Ziel war es, die Bindungsstelle des Profilins in Zellen zu kartieren, sowie die Funktion der Rho-Bindungsstelle näher zu untersuchen, da diese nach Expression in Zellen extensives Ruffling verursacht. Durch die Benutzung verschiedener Deletionsfragmente, in vitro Experimente und transient transfizierter HeLa-Zellen, konnte gezeigt werden, daß die Interaktion mit Profilin über die prolinreiche FH1-Domäne vermittelt wird. Diese Ergebnisse konnten in vivo bestätigt werden. Stabil exprimierende CHO-Transfektanten, welche die Rho-Bindungsdomäne von mDia1 überexprimieren, weisen massive Membranaktivitäten, im Vergleich zu Zellen, welche das wt-Protein bzw. die Kontrolle EGFP exprimieren, auf. Zusätzlich zeigen die (1mDia exprimierenden Zellen eine schnellere Zellausbreitung, jedoch eine verlangsamte, gerichtete Lokomotion. Der Effekt des Rufflings benötigt desweiteren die homologe (1mDia-Sequenz, in humanen Zell-Linien tritt dieser Effekt nicht auf. Durch Verwendung dominant negativen Rac's konnte das Ruffling unterdrückt werden. Vermutlich kommt es zu einer Aktivierung des endogenen mDia1-Proteins nach Expression von (1mDia, indem dieses die intramolekulare Bindung des wt-Proteins aufbricht. Durch die Aktivierung des endogenen mDia1 kommt es zur vermehrten Bindung zellulären Rho-GTP's an dessen Rho-Interaktionsstelle. Als Konsequenz wird ein Anstieg Rac-vermittelter Effekte beobachtet, da es durch die vermehrte Wechselwirkung von endogenem mDia1 und GTP-Rho zu einer Verschiebung des Gleichgewichtes zwischen den kleinen GTPasen kommt