Entwicklung alternativer Methoden zur Nukleotid-Analytik in der Bioprozeßüberwachung

In der vorliegenden Arbeit wurden alternative Methoden zur bisher in der Bioprozeß-überwachung eingesetzten HPLC-Nukleotidanalytik entwickelt, so daß mit Hilfe von enzymatischen und elektrophoretischen Prinzipien eine on-line Überwachung über die Bestimmung relevanter Einzelparameter unter einer deutlichen Verkürzung der Analysendauer möglich wurde. Die Untersuchungen wurden anhand von zwei Analyten durchgeführt: zum einen wurde Xanthin ausgewählt, das eine direkte Kopplung mit dem Zellwachstum aufwies und zudem extrazellulär im Medium vorlag, und zum anderen Adenosintriphosphat (ATP) als intrazelluläre Komponente, das zwar nur indirekt über den Adenylate Energy Charge Wechselwirkungen mit dem Wachstumsverhalten zeigte, aber eines der wichtigsten Nukleotide darstellt. Die Basis zur Entwicklung geeigneter Detektionssysteme bildeten zunächst amperometrische Biosensoren. Zum Nachweis von ATP wurde das Enzympaar Hexokinase/Glucose-Oxidase gewählt, das auf verschiedene Trägermaterialien co- oder separat immobilisiert wurde. Zur Bestimmung von Xanthin wurde die Reaktion der Xanthin-Oxidase ausgenutzt, die über Polymereinschluß-Verfahren direkt auf die Arbeitselektrode einer Dickschichtelektrode oder über Quervernetzung auf Glas-Beads gebunden wurde. Die resultierenden Biosensoren wurden anschließend hin-sichtlich ihrer Stabilität und Sensitivität in einem Fließsystem charakterisiert. Neben dem enzymatischen Assay wurde Xanthin auch über elektrophoretische Verfahren nachgewiesen, wobei hierfür sowohl ein kommerzielles Kapillarelektrophorese-Instrument als auch integrierte mikrofluide Strukturen (Lab-on-a-Chip) zum Einsatz kamen. Mit Hilfe der miniaturisierten Systeme konnte im Vergleich zum Makrosystem das erforderliche Probenvolumen und der Reagenzienverbrauch reduziert und die Analyendauer deutlich verkürzt werden.