Tubulysin aus Myxobakterien : Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus
Tubulysin wirkt cytopathogen und hat ein sehr starkes cytotoxisches Potential. Es führte zu lichtmikroskopisch sichtbaren Veränderungen der tierischen Zelle in Zellkulturen. Nach Zugabe von Tubulysin nahmen PtK2-Zellen (Potoroo Nierenzellen) innerhalb weniger Stunden im Vergleich zur Kontrolle eine abgerundete Gestalt an und hafteten weniger gut aneinander. Eine längere Inkubation der Zellen mit Tubulysin führte zu einer Vergrößerung der Zellen und zum Zerfall der Zellkerne, die sich in Zellkernfragmente zerteilten (Apoptose). Immunfluoreszenzfärbung zeigte, daß Tubulysin die Zellmikrotubuli schon in geringer Konzentration schnell angreift. Das gesamte Mikrotubulisystem wurde innerhalb von 24 Stunden bis auf die MTOCs vollständig abgebaut. Die MTOCs verschwanden später ebenfalls.Vermutlich greift Tubulysin auch das gamma-Tubulin an. Die PtK2 Zellen konnten sich nach dem Entfernen von Tubulysin aus dem Kulturmedium auch nach mehrmaligem Waschen nicht erholen; d. h. die Wirkung von Tubulysin war irreversibel. Tubulysin induziert eine Apoptose, die sich in einer konzentrationsabhängigen Zunahme von cytoplasmatischen Mono-und Oligonukleosomen und einer Zunahme von DNA-Fragmenten im Cytoplasma zeigte. Elektrophotetisch konnte eine sogenannte Apoptoseleiter bei U-937 Zellen nach Behandlung mit Tubulysin A oder Tubulysin D nachgewiesen werden. Eine kombinierte Zugabe von (die Mikrotubuli stabilisierendem) Taxol oder Epothilon B und Tubulysin zeigte, daß die Wirkung von Tubulysin auf die Zellmikrotubuli durch die beiden Substanzen nicht beeinflußt wird. Tubulysin blockiert die Bildung von Mitosespindeln, die für eine Segregation der Tochterchromosomen bei der Mitose verantwortlich sind. Zellzyklus-Untersuchungen zeigten, daß die Zellen nach der Zugabe von Tubulysin in der G2/M-Phase akkumulierten. Tubulysin hemmt die Tubulinpolymerisation in vitro....
Tubulysins, depsipeptides, are a new class of cytotoxic metabolites produced by strains of myxobacteria, Archangium gephyra, Angiococcus and Stigmatella. They contain several unusual (unique) amino acids subunits. The cytotoxic compounds inhibit the growth of various animal cell lines. The IC50, measured by MTT-Test, was 200 and 20 pg for tubulysin A and tubulysin D, respectively. Indirect immunofluorescence microscopy of PtK2 Potoroo cells stained with alpha-tubulin-specific antibodies showed that tubulysins interfer with cytoplasmic and spindel microtubules of cultured cells in a time and concentration-dependent manner. Tubulysin A (20 ng/ml) caused a total loss of the cells microtubular networks 24 h after its addition excepting the MTOCs that disappeared completely later. We suggest that tubulysins interfer with gamma-tubulin. The disassembly of microtubules by tubulysins was not affected by preincubation of cultured cells with either taxol or epothilon B. PtK2 cells in untreated cultures were characterized by single nuclei as revealed by DAPI staining. In contrast, cells treated with tubulysin at concentration of 20 ng/ml were frequently multinucleated as an indication for apoptosis. The induction of apoptosis by tubulysins was chracterized morphologically by nuclear collapse and biochemically by determination of internucleosomal DNA fragmentation and demonstration of apoptotic ladder. Microtubules in mitotic cells were also affected by tubulysins that caused mitotic arrest. For instance nearly 56 of the L929 cells were arrested in the G2/M phase 24 hours after the addition of 30 nM tubulysin A and about 75 of the cells were arrested 48 hours after its addition. Tubulysins inhibited in vitro polymerization of tubulin isolated from porcine brain and depolymerized performed microtubules....
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