Konditionelle Genausschaltung in der Maus : Effektive Steuerung durch ein kombiniertes Regulationssystem

Köster, Markus

doi:10.24355/dbbs.084-200511080100-215

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Konditionelle Genausschaltung in der Maus : Effektive Steuerung durch ein kombiniertes Regulationssystem

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In der vorliegenden Arbeit wurden Studien zur Generierung eines Zelltyp-spezifischen und zeitlich regulierbaren Rekombinationssystems in vivo in der Maus durchgeführt. Sie stellen die Voraussetzung für einen 'konditionellen Knock-Out' eines beliebigen Gens in vivo dar. Die Verfahren zur homologen Rekombination von ES-Zellen und deren anschließenden Transfer in Maus-Blastozysten ermöglicht im Prinzip die funktionelle Analyse jedes Gens in vivo in der Maus. In manchen Fällen resultiert die Ausschaltung eines Gens jedoch in einen letalen Phänotyp, was seine Analyse zu späteren Entwicklungsstadien ausschließt. Exakt diese Situation fand man bei der Ausschaltung des myogenen Faktors Myf5 vor. Homozygote Myf5-/- Mäuse starben bei ihrer Geburt aufgrund einer schweren Rippenmißbildung. Dieses verhinderte die Analyse des Myf5 Gens zu späteren Entwicklungsphasen der Maus und in Prozessen der Muskelregeneration. Daher wurde in embryonalen Stammzellen ein gefloxtes Myf5 Allel generiert, das eine kon-ditionelle Mutagenese von Myf5 mit dem Cre/loxP System aus dem Bakteriophagen P1 er-möglicht. Die sequenzspezifische Rekombinase Cre kann dabei zwischen zwei loxP Sequen-zen rekombinieren und eine Deletion des dazwischen liegenden DNA-Abschnitts bewirken. Aus den embryonalen Stammzellen konnte ein Myf5loxP/loxP Mausstamm erzeugt werden. Wie erwartet, waren homozygote Myf5loxP/loxP Mäuse lebensfähig und konnten für die konditionel-le Mutagenese eingesetzt werden. Die Kreuzung von Myf5loxP(+/wt) Mäusen mit transgenen Mx:Cre Mäusen wiesen die Funktionalität der loxP Sequenzen nach und führten zu einem zeitabhängigen und gewebespezifischen 'Knock-Out' des Myf5 Gens in vivo. In einem weiteren Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit wurden in vitro Studien zur Regula-tion der Cre Rekombinase durchgeführt. Dabei konnte die Cre Aktivität durch eine Kombina-tion transkriptioneller und posttranslationaler Kontrollelemente wirksam reguliert werden.

Towards the Generation of a Cell-type Specific and Conditional Active Recombination system in mice in vivo Conventional knock-out strategies in mice lead to a constitutive inactivation of the gene of interest. Ideally, the resulting phenotype serves as an indicator of the gene´s original function. However, very often null mutations of genes which might have important functions in later life result in embryonic lethality thereby preventing analysis of the gene´s functions in physio-logical and pathological processes later in life. This problem was encountered when myf5, a muscle regulatory transcription factor, was mu-tated. Resulting mice died perinatally due to rib malformation preventing analysis of myf5 in muscle regeneration and generation of muscle subtype formation. A strategy which is based on the Cre/loxP system was developed to assess myf5 function in vivo in more detail. In a first step the Cre/loxP system has been revised to improve its regulation. Therefore a model has been developed in which Cre activity is controlled both by a transcriptional and a posttranslational mechanism. Both check points are ultimately commanded by Ecdysone, a steroid receptor ligand from D. melanogaster. The transcriptional control is based on an amendment of R. Evans inducible system and is achieved on binding of Ecdysone to a RXR/Ecdysone-receptor fusion which then binds to its cognate DNA-binding sequence. The posttranslational control is accomplished by fusing the Cre recombinase to the HBD-domain of the Ecdysone receptor. The HBD domain used carried a small N-terminal deletion to confer its properties onto the fusion protein. All fusions were shown to bind to Ecdysone in competition assays. The Cre recombinase was successfully controlled by the combinatory system in an established fibroblastoid cell line as well as in ES-cells. Aspects of induction were assessed in a transient transfection assay using the pPGKloxPSTOPloxPLacZ (pPGKpaX1 @ pPac1) construct