Analysen zur Identifizierung von Interaktionspartnern der Molybdän-Insertase Cnx1 aus Arabidopsis thaliana
Der Molybdäncofaktor ist essentieller Bestandteil aller eukaryotischen Molybdoenzyme. In A. thaliana vermittelt das Cnx1-Protein die Molybdän-Übertragung auf Molybdopterin. Anhand der Homologie zum humanen Gephyrin, das zahlreiche Protein-Wechselwirkungen eingeht, wurde auf das Vorhandensein unbekannter Cnx1-Interaktionspartner geschlossen. Die vorliegende Arbeit war auf die Detektion von Proteinen fokussiert, die als Liganden an die pflanzliche Molybdän-Insertase binden. Als konservierte Äquivalente von humanen Gephyrin-Interaktionspartnern kamen A. thaliana Profiline und die GABARAP-homologen APG8-Proteine für eine Cnx1-Wechselwirkung in Frage. Hinsichtlich einer möglichen Cnx1-Profilin-Bindung konnten jedoch keine eindeutigen Ergebnisse erzielt werden. Im Falle der neun APG8-Proteine ergaben sich aufgrund biochemischer Ansätze für APG8g, h und i Hinweise auf eine Interaktion mit Cnx1. Zur Suche nach neuen Interaktionspartnern wurde das USPS-System für eine Cnx1-Bait-Fusion etabliert. Das Screening einer A. thaliana cDNA-Bank resultierte in der Identifizierung von fünf Proteinen, die potentiell mit der pflanzlichen Molybdän-Insertase in Wechselwirkung stehen. Mit der putativen Nukleotid-Hydrolase HIT konnte ein Protein bestimmt werden, für das eine Cnx1-Interaktion sehr wahrscheinlich ist. Weiterhin sprechen mehrere Anhaltspunkte für eine Cnx1-Wechselwirkung der Thioredoxine TRX H2/H3, des putativen Urease Hilfs-Proteins UreG sowie der Adenin Phosphoribosyltransferase APRT1. In Form des möglicherweise an Cnx1 bindenden putativen Kupfer-Chaperons CCH ergab sich eine potentielle Verbindung zur Umsetzung von Kupfer-Molybdopterin im dritten Schritt der Moco-Biosynthese und somit ein neuer Hinweis auf eine Vernetzung von Molybdän- und Kupfer-Stoffwechsel. Durch die Identifizierung neuer putativer Cnx1-Interaktionspartner konnte die Grundlage für Experimente zur endgültigen Verifizierung der Wechselwirkungen sowie zu deren funktioneller Charakterisierung geschaffen werden.
The molybdenum cofactor is essential compound of all eukaryotic molybdoenzymes. In A. thaliana the Cnx1 protein catalyzes the molybdenum transfer to molybdopterin. According to the homology to its human counterpart Gephyrin that undergoes several protein interactions, the presence of yet unknown Cnx1 binding proteins was proposed. The present work was focussed on the detection of proteins being ligands of the plant molybdenum insertase. As conserved equivalents of human Gephyrin binding proteins, A. thaliana Profilins and the GABARAP-homologous APG8 proteins were considered to putatively interact with Cnx1. Nevertheless, no consistent results could be achieved in case of assumed Cnx1-Profilin binding. Regarding the nine APG8 proteins, evidences for Cnx1 interactions of APG8g, h and i were obtained using biochemical approaches. In order to search for novel Cnx1 ligands, the USPS system was established for a Cnx1 bait fusion. Screening of an A. thaliana cDNA library resulted in the identification of five proteins putatively interacting with the plant molybdenum insertase. In case of the putative Nucleotide Hydrolase HIT, a protein could be determined that is very likely binding to Cnx1. Moreover, several results were found indicating towards a Cnx1 interaction of Thioredoxins TRX H2/H3, the putative Urease accessory protein UreG and the Adenine Phosphoribosyltransferase APRT1. The possibly Cnx1 binding copper chaperone CCH provides a putative connection to the turnover of copper molybdopterin within the third step of moco biosynthesis and can therefor considered to present new evidence for a linkage between molybdenum and copper metabolism. By the identification of novel putative Cnx1 ligands, the base for further approaches could be generated in order to finally verify those interactions and to investigate and characterize their functional implications.
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