Optimierung der Kultivierung und Monitoring der Proliferation und Differenzierung humaner primärer Knochenvorläuferzellen

Da die Verbesserung der In-vitro-Kultivierung isolierter osteogener Zellen und die verlässliche Überwachung des Kultivierungsprozesses zwei sehr wichtige Aspekte des Knochen-Tissue-Engineerings darstellt, wurden in der vorliegenden Arbeit die Kultivierungsbedingungen für humane primäre Knochenvorläuferzellen optimiert und eine Auswahl an Analysetechniken, welche den Verlauf der Osteogenese umfangreich widerspiegeln, zusammengestellt. Bevorzugt wurden dabei nicht-invasive Methoden, da nur diese die Zerstörung der 3D-Knochenimplantate während ihrer Herstellung ausschließen. Bei der Optimierung der Kultivierung wurden die osteogenen Humanzellen parallel in DMEM, alphaMEM, RPMI 1640 und ZKT-I-Medium kultiviert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Wahl des Mediums einen deutlichen Einfluss auf die Osteogenese, insbesondere auf die Mineralisierung der extrazellulären Matrix ausübt und dieser Prozess stark von der Calcium-Konzentration im Medium abhängig ist. Darüber hinaus wurde dargelegt, dass ein mit Humanserum (HS) angereichertes Medium für die Kultivierung humaner osteogener Zellen viel besser geeignet ist als ein FBS-haltiges, welches sowohl zu schwachem Zellwachstum als auch zu stark verzögerter Osteogenese führt. Die Kultivierung humaner osteogener Zellen in einem serumreduzierten Medium (2% HS + 5 ng/ml PDGF-BB + 5 ng/ml EGF) zeigte, dass dies wegen des stark überhöhten Tempos der Zelldifferenzierung nur über einen Zeitraum von ca. 2 Wochen und unter einer stetigen Zugabe von Wachstumsfaktoren anwendbar ist. Aus der Gesamtheit untersuchter Analyseverfahren wurden 6 Methoden ausgewählt (Ermittlung des Calcium- und Glucoseverbrauchs, der Lactatproduktion, der CICP-Freisetzung, der Aktivität von ALP, LDH und der Caspasen 3/7 im Kulturüberstand), die für eine nicht-invasive Überwachung humaner osteogener Zellkulturen ausreichend sind. Ferner wurde ein knochenspezifischer Microarray entwickelt, der eine Aussage über die Expression von 73 relevanten Genen ermöglicht.