Structural and biochemical analysis of Nck1 and Nck2 SH2 domains
The human adapter protein Nck is an important modulator of the actin cytoskeleton. It also is crucial to the infection strategy of enteropathogenic E.coli (EPEC). On contact with human intestinal cells, the EPEC type III secretion system translocates the virulence factor Tir (translocated intimin receptor) into the host cytoplasm which is subsequently inserted into the host cell membrane. Upon tyrosine phosphorylation, the cytoplasmic, C-terminal domain of Tir becomes a high-affinity ligand to the SH2 domain of Nck. Recruitment of Nck results in local remodeling of the host cell cytoskeleton leading to the formation of actin-rich pedestals on which the bacteria reside. Two isoproteins of Nck, Nck1 and Nck2, exist in vertebrates, both of which are recruited by phosphorylated Tir. The precise cellular functions of Nck1 and Nck2 presently remain unclear, though both have been reported to bind a number of human proteins through their SH2 and SH3 domains. Differences between Nck1 and Nck2 likewise remain elusive as several interaction partners are known to bind both proteins whereas others have been reported to interact exclusively with a single Nck family member. The binding properties of Nck1 and Nck2 SH2 domains were investigated both biophysically and structurally to resolve their ligand recognition specificity. Of all binding partners examined, both Nck1 and Nck2 bind a Tir-derived tyrosine phosphorylated peptide with highest affinity. Crystal structures of the Nck1 and Nck2 SH2 domains in complex with this Tir-derived phosphopeptide as well as the uncomplexed Nck1 SH2 domain reveal a common structure and indicate that ligand-binding involves regions conserved between Nck1 and Nck2. An epitope scan, based on the Tir phosphopeptide, identified the binding specificity of Nck1 and Nck2 confirming that the Tir peptide sequence is essentially optimal for high affinity peptide binding to both proteins. A search of human protein databases using the refined peptide sequence identified potentially new interaction partners for Nck SH2 domains, among them the G-protein coupled receptor kinase interacting protein GIT1. Pull-down assays with both Nck SH2 domains indicate that this predicted interaction may be relevant also in vivo.
Das humane Adapterprotein Nck ist ein wichtiger Modulator des Aktinzytoskeletts. Eine entscheidende Funktion nimmt es ebenfalls in der Infektionsstrategie des enteropathogenen E. coli Bakteriums ein. Bei Kontakt des Bakteriums mit humanen intestinalen Zellen, transloziert es über ein Typ III Sekretionssystem den Virulenzfaktor Tir (Translocated Intimin Receptor) in das Wirtszellzytoplasma, der in die Wirtszellmembran eingebaut wird. Durch Tyrosinphosphorylierung des zytoplasmatischen, C-terminalen Teils von Tir wird Nck über seine SH2 Domäne rekrutiert. Daraus folgt ein lokaler Umbau des Wirtszellzytoskeletts, was zur Bildung von Aktin-reichen Säulen (sogenannten "pedestals") unter den Bakterien führt. Zwei Isoproteine, Nck1 und Nck2, sind in Vertebraten bekannt, die beide durch phosphoryliertes Tir rekrutiert werden können. Die genauen zellulären Funktionen von Nck1 und Nck2 sind noch nicht erforscht, obwohl gezeigt wurde, dass beide eine Vielzahl von Proteinen sowohl über die Nck SH2 als auch die SH3 Domänen binden können. Ebenfalls sind die Unterschiede zwischen Nck1 und Nck2 nicht hinreichend bekannt. Einige Interaktionspartner können beide Isoproteine binden, wohingegen andere nur mit einem der beiden Ncks interagieren können. Die Bindungseigenschaften der Nck1 und Nck2 SH2 Domänen wurden in dieser Studie sowohl biophysikalisch als auch strukturell untersucht um ihre Ligandenspezifität zu bestimmen. Nck1 und Nck2 binden ein Tyrosin-phosphoryliertes Peptid, dass der Bindungsstelle in Tir entspricht, am stärksten von allen untersuchten Peptiden. Die Kristallstrukturen beider Nck SH2 Domänen in Komplex mit dem Tir Peptid ebenso wie die unkomplexierte Nck1 SH2 Struktur zeigen die gängige SH2 Domänen Faltung und weisen darauf hin, dass beide Isoproteine eine konservierte Oberfläche zur Peptidligandenbindung benutzen. Über einen Epitopscan, der auf dem Tir-Peptid basiert, konnten die Bindungsspezifitäten beider SH2 Domänen bestimmt werden. Das bestätigte die Tir-Peptide Sequenz als praktisch optimalen Liganden für beide Nck SH2 Domänen. Potentielle neue humane Interaktionspartner wurden über eine Datenbanksuche mit dem durch den Epitopscan gewonnenen Bindungsprofil identifiziert, darunter das mit an G-Protein gekoppelten Rezeptortyrosinkinasen interagierende Protein GIT1. Pull-down Experimente mit beiden Nck sH2 Domänen bestätigen eine Interaktion mit GIT1 und weisen auf eine in vivo möglicherweise relevante Bindung hin.
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