Die Rolle der Interaktion von N-WASP mit SH2/SH3-Adapterproteinen und Profilin in der intrazellulären Motilität von Shigella flexneri
Der humanpathogene, bakterielle Erreger der Ruhr, Shigella flexneri, nutzt die Aktinpolymerisations-Maschinerie seiner Wirtszelle, um seine intrazelluläre Motilität zu induzieren. Das bakterielle Oberflächenprotein IcsA rekrutiert zu diesem Zweck den zelleigenen Nukleationsfaktor N-WASP, der wiederum die Rekrutierung und Aktivierung des Arp2/3 Komplexes bewirkt. Das für die bakterielle Motilität essentielle N-WASP wird durch die Bindung von IcsA aktiviert. Die bakterielle Motilität kann durch eine Reihe weiterer zellulärer Faktoren wie den SH2/SH3-Adapterproteinen Nck1/2 und Grb2 sowie Profilin gefördert werden. Die Bindung dieser Proteine erfolgt spezifisch über die Poly-Prolin-Domäne von N-WASP. Diese Interaktionen wurden in dieser Arbeit biochemisch charakterisiert, um ihren Einfluss auf die bakterielle Motilität von Shigella zu untersuchen. Detaillierte Analysen zeigten, dass die SH3-Domänen von Nck1, Nck2 und Grb2 unabhängig voneinander an ein P5XR-Konsensusmotiv binden, welches fünffach in der N-WASP-Poly-Prolin-Domäne enthalten ist. Die gezielte Mutation dieser Motive schränkte die Bindung der SH3-Domänen von Nck1, Nck2 und Grb2 an N-WASP in vitro stark ein. Die bakterielle Geschwindigkeit von Shigella in Abhängigkeit der Interaktion von Nck mit N-WASP wurde mittels Videomikroskopie von infizierten und rekonstituierten Nck-defizienten und N-WASP-defekten Zellen untersucht. Dabei erwiesen sich Nck1 und Nck2 zwar nicht essentiell für die Aktin-basierte Bewegung von Shigella, jedoch können beide Proteine die Geschwindigkeit der Bakterien bedeutend erhöhen. Des weiteren wurde die funktionelle Redundanz von Nck1 und Nck2 in der Aktin-basierten Bewegung von Shigella dargelegt. Außerdem ist zum Erreichen der Maximalgeschwindigkeit von Shigella die direkte Interaktion von N-WASP mit Nck über die beschriebenen P5XR-Motive notwendig.
The human pathogen Shigella flexneri exploits Arp2/3 complex-mediated actin assembly to drive its intra- and intercellular motility. As opposed to Listeria monocytogenes, which is capable of recruiting Arp2/3-complex directly, Shigella has evolved to usurp the Arp2/3-complex indirectly by interaction of the Shigella surface protein IcsA with the host cell Arp2/3-regulator N-WASP. N-WASP is further activated by additional interacting proteins, such as the SH2/3 adaptors Nck1 and 2, which recruit to and co-localise with N-WASP at the Shigella surface. In this study the relevance of these interactions for Shigella motility were examined. The interaction surfaces within the poly-proline domain of N-WASP were determined for both Nck adaptors and profilin and five consensus P5XR-motifs as interaction sites for SH3-domains were identified. Systematic mutational analysis within these motifs allowed the generation of a N-WASP mutant, the binding of which to SH3-domains was strongly impaired in vitro. Re-expression of this mutant in N-WASP-defective cells restored the velocity of Shigella only to 70% as compared to wildtype N-WASP, while deletion of the entire poly-proline domain restored movement to 50%, indicating an additional contribution of profilin binding. Finally, re-expression of full length Nck1 or Nck2 in Nck1/2 double knockout cells increased Shigella velocity by app. 30% as compared to non-transfected controls, while expression of a single SH3-domain of Nck1 in these cells increased bacterial velocity only by 10%. Together, these data indicate that Nck proteins promote Shigella motility by direct and cooperative binding of their SH3-domains to the multiple interaction surfaces located within the poly-proline domain of N-WASP.
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